آب مقطر فرمولاسیون شیمیایی

دستور العمل تهیه محلولها فقط با آب مقطر

محلول کلرید سدیم ۵ مولار (NaCl 5M)

مقدار ۲۹۲ گرم NaCl در ۶۵۰ سی سی آب مقطر دوبار تقطیر حل شده و سپس حجم به یک لیتر رسانید شود، اتوکلاو شده و در دمای اتاق نگهداری شود.

محلول سود ۱۰ مولار (NaOH 10M)

مقدار ۴۰ گرم NaOH در ۷۵ سی سی آب مقطر دوبار تقطیر حل شده سپس حجم محلول با آب مقطر به یک ۱۰۰ سی سی رسانیده شود، این محلول را باید در ظرف پلاستیکی نگهداری کنید.

محلول سدیم ددوسیل سولفات ۱۰ درصد (SDS 10%)

مقدار ۱۰ گرم سدیم ددوسیل سولفات را در ۸۰ سی سی آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده حجم را با آب مقطر به ۱۰۰ سی سی برسانید. اتوکلاو شده در دمای اتاق نگهداری شود.

محلول اتیلن دی آمین تترا استیک اسید ۵/۰ مولار (۸ pH= EDTA 0.5M)

مقدار ۱۲/ ۱۸۶ گرم EDTA را در ۷۵۰ میلی لیتر آب مقطر دوبار تقطیر حل نمایید بر روی یک همزن مغناطیسی آنرا به شدت بهم بزنید تا کاملا حل بشود. pH محلول را با استفاده از سود ۱۰ مولار به ۸ برسانید (حدود ۵۰ میلی لیتر) سپس با آب مقطر به حجم یک لیتر برسانید. اتوکلاو نموده و این محلول را در یخچال نگهداری نمائید.

محلول تریس اسید کلریدریک ۲ مولار (pH=8 Tris-HCl 2M)

مقدار ۲/۲۴۲ گرم تریس را در ۷۵۰ سی سی آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده بعد از حل شدن کامل pH محلول که تقریبا ( ۱۱-۵/۱۰) می باشد باید به ۸ رسانیده شود. تنظیم pH باید با استفاده از اسید کلردریک غلیظ و در زیر هود انجام شود در موقع تنظیم pH به این نکته توجه شود که اضافه کردن HCl باعث افزایش دما و کاهش pH محلول می شود، باید صبر کرد تا دمای محلول به دمای محیط برسد، اضافه کردن HCl را باید تا زمانی ادامه داد که pH محلول در دمای محیط به ۸ برسد بعد از این مرحله حجم محلول با آب مقطر دوبار تقطیر استریل به یک لیتر رسانده شود، اتوکلاو شده و در دمای اتاق نگهداری شود.

محلول استات آمونیم ۵ مولار (Ammonium acetate 5M)

۵۴/۳۸ گرم آمونیم استات را در ۷۰ سی سی آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده، با آب مقطر حجم را به ۱۰۰ سی سی برسانید و آنرا در دمای اتاق نگهداری دارید.

محلول استات پتاسیم ۵ مولار (pH= 5.5 Potassium acetate 5M)

مقدار ۷۵/۴۹ گرم از این ماده را در ۶۵ سی سی آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده حجم با استفاده از آب مقطر به ۱۰۰ سی سی رسانده شود. برای تنظیم pH مورد نظر قبل از به حجم رسانیدن از اسید استیک گلاسیال استفاده می شود. این محلول را در دمای محیط نگهداری نمایید.

محلول سدیم استات ۵ مولار (pH= 4.5 Sodium acetate 5M)

مقدار ۴/۶۸ گرم از این ماده را در ۷۰ سی سی آب مقطر دوبارتقطیر استریل حل کرده حجم با آب مقطر به ۱۰۰ سی سی رسانده شود، برای تنظیم pH مورد نظر قبل از به حجم رسانیدن از اسید استیک گلاسیال استفاده می شود. این محلول در دمای اتاق نگهداری می شود.

محلول اتیدیوم بروماید mg/ ml 10 (Ethidium Bromide Solution)

مقدار ۱۰۰ میلی گرم اتیدیوم بروماید را در ۱۰ میلی لیتر آب مقطر دوبار تقطیر استریل حل نموده چندین ساعت با همزن بهم بخورد تا از حل شدن آن مطمئن شوید، سپس با آلومینیوم فویل پوشانده شود. این محلول را در یخچال نگهداری نمایید.

محلول آر ان آز/ ml mg 10 (RNase A)

مقدار ۱۰میلی گرم RNase را در یک میلی لیتر آب مقطر دوبار تقطیر استریل حل کنید. برای از بین بردن DNase احتمالی بایستی ۱۵ دقیقه در ۱۰۰ درجه سانتی گراد (آب در حال جوش) قرار داده شود. بهتر است این محلول را در مقادیر ۵۰ میکرولیتری تقسیم کرده و در c˚۲۰- نگهدرای شود.

محلول پروتئیناز K (Proteinase K)

مقدار ۱۰ میلی گرم پروتئیناز K را در یک میلی لیتر آب مقطر دوبار تقطیر استریل حل کرده و در c˚۲۰- نگهداری شود.

محلول بافر الکتروفورز تریس استیک اسید- EDTA (TAE)

تهیه محلول استوک X10 با pH=8.5

مقدار ۴/۴۸ گرم تریس بازی را باضافه ۴/۱۳ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال و ۷۴ گرم EDTA در آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده حجم را به یک لیتر برسانید، اتوکلاو شده و در دمای اتاق نگهداری شود.

محلول بافر الکتروفوز تریس بوریک اسید (TBE)

تهیه محلول استوک X10

مقدار ۱۰۸ گرم تریس بازی را باضافه ۵۵ گرم اسید بوریک و ۴۰ میلی لیتر EDTA نیم مولار با PH=8 در آب مقطر دوبار تقطیر حل کرده حجم را به یک لیتر برسانید، اتوکلاو شده و در دمای اتاق نگهداری شود.

بافر TEN (Tris/EDTA/NaCl)

مقدار ۴۰ میلی لیتر تریس اسیدی (۲M, pH=8)، یک میلی لیتر (pH=8 EDTA 0.5) و ۱۵۰ میلی لیتر
(۱۰M) NaCl را با هم مخلوط کرده سپس حجم با آب مقطر دوبار تقطیر به یک لیتر رسانده شود، اتوکلاوه شده در دمای اتاق نگهداری شود.

از این بافر برای قرار دادن محلول DNA یا محصول واکنش PCR در چاهکهای ژل آگاروز استفاده می شود. برای تهیه ۲۰ میلی از این محلول به صورت زیر %۰.۵ بروموفنل آبی، %۴۰ سوکروز، ۰.۱M EDTA PH=8 و %۰.۵ SDS با همدیگر مخلوط کرده و حجم را به ۲۰ سی سی می رسانیم.
حجم بافر با آب مقطر دو بار تقطیر استریل به حجم رسانیده شود.

بافر EDTA-Tris-HCl (TE)

مقدار ۵۰۰ میکرولیتر Tris –HCl PH=8 دو مولار و ۲۰۰ میکرولیتر Na2EDTA 0.5M PH=8 را به ۹۰ میلی لیتر آب مقطر دوبار تقطیر اضافه کرده حجم را با آب مقطر دوبار تقطیر به ۱۰۰ سی سی برسانید، اتوکلاو شده در دمای اتاق نگهداری شود.

ژل آگاروز (Agarose Gel)

این ژل معمولا به میزان ۱% در بافر TAE، TBE و یا TPE تهیه می شود. برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر از این ژل یک گرم آگاروز را در داخل ارلن ریخته، ۱۰۰سی سی با فر ژل X1 به آن اضافه کرده و به مدت ۶۰ ثانیه در داخل میکروفر (و یا زمان کافی روی اجاق همزن الکتریکی) حرارت دهید تا بجوش آید و آگاروز کاملا حل شود.

استخراج DNA ژنومی به روش موری و تامپسون (۱۹۸۰ Murry&Thompson,)

۱- توزین ۵/۰ گرم نمونه برگی.
۲- پودر کردن نمونه برگی در حضور ازت مایع در هاون چینی اتوکلاو شده و از قبل در فریزر سرد شده.
۳- اضافه کردن مقدار ۵ میلی لیتر از بافر استخراج به هر نمونه و انتقال سریع نمونه ها به لوله های سانتریفیوژ ۱۵ میلی لیتری (فالکون).
۴- قرار دادن نمونه در حمام آب گرم C ˚۶۵ به مدت ۳۰ دقیقه. در حین این مدت لوله ها چندین مرتبه تکان داده شوند.
۵- اضافه کردن سه میلی لیتر از مخلوط کلروفرم ایزوآمیل الکل ۲۴ به ۱ به هر لوله و چندین سر و ته کردن لوله (Inverting). سانتریفیوژ در ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه (rpm) به مدت ۱۵ دقیقه.
۶- انتقال رو شناور به لوله سانتریفوژ ۱۵ میلیمتری جدید با استفاده از سمپلر.
۷- اضافه کردن ایزوپروپانول خالص سرد به مقدار ۶/۰ حجم محلول (حجم روشناور که برداشته شده است که معمولا ۲ میلی لیتر است) و سر و ته کردن (Inverting) به آرامی، قرار دادن نمونه ها به مدت ۵ دقیقه در شرایط آزمایشگاه. در این مرحله توده ژله ای بی رنگ DNA قابل مشاهده است.
۸- سانتریفیوژ لوله ها در rpm 10000 به مدت ۱۵ دقیقه تا DNA در کف لوله رسوب کند.
۹- خالی کردن مایع بالایی توده DNA‌ به آرامی، طوری که رسوب در لوله باقی بماند.
۱۰- شستشوی رسوب محتوی DNA‌ (پلت) دو بار با اتانول ۷۵% با توجه به عدم خروج رسوب از لوله هنگام خالی کردن اتانول. قرار دادن لوله ها به مدت ۳۰ دقیقه در معرض جریان هوا به صورت وارونه روی دستمال کاغذی تا رسوب حاصله خشک شود.
۱۱- اضافه کردن ۵۰۰ میکرو لیتر آب مقطر دو بار تقطیر استریل به لوله ها و قرار دادن نمونه به مدت یک شب در یخچال در دمای C ˚۴ تا توده DNA داخل آب مقطر حل شود.

بافر استخراج موری و تامپسون Murray &Thompson Extraction buffer

در نهایت حجم بافر را با آب مقطر دوبار تقطیر استریل به ۱۰۰ سی سی برسانید.
توجه: بتا مرکاپتواتانول را بعد از اتوکلاو کردن و درست قبل از مصرف به بافر اضافه کنید.